Kejuruteraan enzim berpasangan pertumbuhan melalui manipulasi regenerasi kofaktor redoks

Semakin pelbagai jenis bahan kimia kini dihasilkan daripada bahan mentah boleh diperbaharui melalui kaedah bioteknologi. Bioproses sangat bergantung pada katalisis enzimatik untuk penghasilan sebatian ini dengan cekap. Memastikan enzim berfungsi dengan optimum dalam persekitaran yang diperlukan adalah sangat penting untuk pengeluaran lestari.

Sifat seperti spesifisiti substrat, kadar katalitik dan kestabilan (termo)adalah antara beberapa faktor kritikal yang mesti dioptimumkan untuk bioproses yang dipacu oleh enzim yang cekap. Pengoptimuman ini boleh memakan masa, mahal, dan mencabar, dan oleh itu cara yang berkesan dan menjimatkan kos untuk pemilihan berpasangan pertumbuhan, enzim kejuruteraan dengan ciri-ciri yang diingini sangat dicari.

Kelebihan menggunakan pemilihan berpasangan pertumbuhan sebagai satu bentuk pemilihan enzim, yang melibatkan pengaitan aktiviti enzim dengan pertumbuhan sel. Kaedah ini boleh digunakan sebagai strategi pemilihan berkelajuan tinggi, dan boleh dicapai sama ada dengan memastikan pertumbuhan bergantung kepada sintesis produk oleh enzim sasaran atau dengan menghubungkan aktiviti enzim kepada keadaan tenaga global sel. Biologi sintetik boleh digunakan untuk mereka bentuk strain yang sesuai untuk pemilihan berpasangan pertumbuhan, dan kemajuan terkini menumpukan pada kejuruteraan strain yang kekurangan dalam keadaan teroksida atau terkurang pasangan kofaktor redoks, yang boleh berfungsi sebagai platform kejuruteraan enzim. Penggunaan platform ini mungkin mempercepatkan pembangunan biokatalis dan bioproses yang dipertingkatkan.

Manfaat penggandingan pertumbuhan melalui kofaktor auxotrophy

Manfaat menggunakan kofaktor auxotrophy sebagai kaedah pemilihan untuk kejuruteraan enzim yang terlibat dalam biosintesis bahan kimia tertentu, seperti lipid, biofuel, gas, pelarut organik, atau sebatian polimer. Pendekatan ini menawarkan beberapa manfaat unik, termasuk keupayaan untuk memilih produk yang dikehendaki secara bebas daripada substrat atau produk yang diminati, memudahkan pengesanan aktiviti enzimatik yang lebih baik, dan menawarkan bacaan untuk mengesan aktiviti enzimatik yang bertambah baik. Selain itu, penggunaan kofaktor auxotrop sebagai platform gandingan pertumbuhan adalah bermanfaat kerana sifat kodoks redoks yang meluas dalam metabolisme mikrob bermakna strategi kejuruteraan boleh dipindahkan secara lateral kepada mikrob lain yang diminati, dan enzim boleh direka secara langsung dalam persekitaran hos mikrob yang dikehendaki. (ditunjukkan sebagai rajah 1)

Rajah 1: Perbandingan beberapa teknik penapisan/pemilihan yang digunakan secara meluas untuk kejuruteraan enzim

Mutan yang kekurangan pengoksidaan NADH

Pengoksidaan NADH dalam E. coli boleh berlaku melalui dua laluan, bergantung pada ketersediaan oksigen. Di bawah keadaan aerobik, NADH kebanyakannya dioksidakan melalui respirasi untuk menghasilkan ATP, manakala dalam keadaan anaerobik, ia boleh dioksidakan melalui laluan penapaian untuk menghasilkan laktat dan etanol. Strain mutan E. coli, yang tidak dapat menggunakan laluan penapaian campuran untuk pengoksidaan NADH semasa pertumbuhan anaerobik, telah digunakan untuk memacu laluan pengoksidaan NADH bagi sintesis anaerobik pelbagai bahan kimia, seperti 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol, dan L-alanin. Strain mutan ini juga telah digunakan untuk mereka bentuk enzim dengan memanfaatkan prinsip redoks yang serupa, menghasilkan varian yang dipertingkatkan. Strain yang terhasil boleh digunakan untuk mereka bentuk enzim dan laluan bergantung NAD(P)H yang lain.

Mutan yang kekurangan pengurangan NAD+  

Wenk et al. mencipta strain E. coli dengan memadamkan gen dihydrolipoyl dehydrogenase (lpd), yang menyebabkan strain tersebut tidak dapat menjana kuasa pengurangan (NADH dan NADPH) daripada metabolisme asetat disebabkan ketiadaan aktiviti piruvat dehidrogenase. Ini menyebabkan strain menunjukkan auxotrophy untuk mengurangkan kuasa apabila ditanam secara aerobik pada asetat sebagai satu-satunya sumber karbon. (ditunjukkan sebagai rajah 2) Strain ini dapat tumbuh pada asetat apabila ditambah dengan substrat glikolitik atas atau apabila mengekspresikan dehidrogenase formate, etanol atau metanol bergantung NAD+ dengan substrat masing-masing. Strain ini tidak digunakan untuk kejuruteraan enzim dan hanya dinilai untuk redoks kofaktor auxotrophy.
 

Rajah 2: Metabolisme Pusat 

Mutan yang kekurangan pengoksidaan NADPH

Terdapat dua strategi berbeza untuk menginduksi NADP+ auxotrophy dalam E. coli, bergantung kepada kejuruteraan laluan glikolitik untuk menghasilkan NADPH secara berlebihan. Strategi pertama melibatkan penghapusan gen GapA asli dan mengekspresikan enzim GAPDH yang bergantung kepada NADP+ secara heterologus, manakala strategi kedua melibatkan mengalihkan fluks karbon melalui laluan pentosa fosfat. Strain yang terhasil tidak dapat tumbuh pada glukosa tetapi menunjukkan pertumbuhan dalam keadaan berbeza, dengan strain pertama ditanam dalam keadaan anaerobik dan strain kedua di bawah keadaan aerobik dengan gliserol sebagai substrat. Strain ini digunakan untuk kejuruteraan enzim dengan sifat yang dipertingkatkan, termasuk spesifisiti substrat, aktiviti katalitik, dan termostabiliti.

Mutan yang kekurangan pengurangan NADP+

Tiga bakteria berbeza, E. coli, P. putida, dan C. glutamicum, telah direka untuk menjadi NADPH-auxotroph, bermakna mereka memerlukan NADPH eksogen untuk pertumbuhan. Dalam kes E. coli dan C. glutamicum, enzim metabolik pusat telah dikeluarkan untuk mengelakkan pengurangan NADP+ apabila glukosa disediakan sebagai sumber karbon, manakala dalam P. putida, kejuruteraan berbantuan CRISPR/nCas9 digunakan untuk mengganggu set gen sasaran secara berurutan bagi memahami penglibatannya dalam metabolisme redoks. Strain NADPH-auxotrofik kemudian digunakan untuk kejuruteraan enzim berpasangan pertumbuhan berdasarkan spesifikasi kofaktor. Satu pusingan mutagenesis menggunakan E. coli menghasilkan dehidrogenase formate yang paling cekap dan spesifik bergantung kepada NADP+ setakat ini, manakala P. putida dan C. glutamicum mewakili strain pertama spesies mereka yang boleh digunakan untuk jenis kejuruteraan ini.

Mutan yang kekurangan pengurangan NMN+

Sistem pemilihan berpasangan pertumbuhan telah dibangunkan untuk menghubungkan kitaran kofaktor dan pertumbuhan berdasarkan kekurangan pengurangan NMN+. Strain E. coli SHuffle digunakan, yang membawa penghapusan dalam dua gen yang terlibat dalam penghasilan glutathione yang dikurangkan. Glutathione reduktase bergantung NMNH telah dibangunkan melalui mutagenesis rasional untuk menghubungkan proses ini dengan kitaran NMN+/NMNH, dan glukosa dehidrogenase bergantung NMN+ digunakan untuk menyokong kitaran kofaktor NMN+/NMNH dan seterusnya pertumbuhan. Kajian ini juga menggunakan redoks kofaktor auxotrophy bukan kanonik untuk kejuruteraan enzim berpasangan pertumbuhan buat pertama kali, menghasilkan varian fosfit dehidrogenase yang termostabil dengan kecekapan katalitik yang lebih baik dan kestabilan temporal secara in vitro. Kerja ini menyediakan regangan berguna untuk kejuruteraan enzim berpasangan pertumbuhan, bergantung pada kitaran NMN+/NMNH dan auxotrofik untuk keadaan pengurangan kofaktor redoks bukan kanonik.

Potensi pertumbuhan-penggandingan melalui kofaktor redoks berfungsi sebagai alat yang berkuasa untuk mereka bentuk biokatalis, terutamanya dalam konteks bioproduksi lestari. Walaupun kemajuan ketara telah dicapai dalam penghasilan strain redoks kofaktor auxotrofik, kenyataan ini mencadangkan bahawa masih terdapat beberapa jalan penyelidikan yang belum diterokai. Salah satu daripadanya melibatkan kejuruteraan strain kofaktor auxotrofik organisma selain E. coli, yang boleh membuka kemungkinan baru untuk kejuruteraan enzim berpasangan pertumbuhan.

Secara keseluruhan, ia mencadangkan bahawa penggunaan gandingan pertumbuhan berasaskan kofaktor redoks mewakili peluang besar untuk kejuruteraan biokatalisis, terutamanya untuk pengeluaran produk yang tidak dapat memenuhi keperluan pendekatan kejuruteraan enzim berkapasiti tinggi yang lain. Ia menekankan keperluan untuk membangunkan biokatalis yang lebih serba boleh dan cekap bagi bioproduksi lestari serta menekankan kepentingan penyelidikan berterusan dalam bidang ini.


Rujukan: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Kejuruteraan enzim berpasangan pertumbuhan melalui manipulasi regenerasi kofaktor redoks, Biotechnology Advances, 2023.