Kejuruteraan enzim gandingan pertumbuhan melalui manipulasi penjanaan semula kofaktor redoks

Pelbagai jenis bahan kimia kini semakin banyak dihasilkan daripada bahan suapan boleh diperbaharui melalui cara bioteknologi. Bioproses sangat bergantung pada pemangkinan enzim untuk pengeluaran sebatian ini dengan cekap. Memastikan enzim berfungsi secara optimum dalam persekitaran yang diperlukan adalah amat penting untuk pengeluaran mampan.

Sifat seperti kekhususan substrat, kadar pemangkinan dan kestabilan (termo) adalah antara beberapa faktor kritikal yang perlu dioptimumkan untuk bioproses berasaskan enzim yang cekap. Pengoptimuman ini boleh memakan masa, mahal, dan mencabar, oleh itu cara yang berkesan dan kos-efisien untuk pemilihan gandingan pertumbuhan, kejuruteraan enzim dengan ciri-ciri yang diingini amat dicari.

Kelebihan menggunakan pemilihan gandingan pertumbuhan sebagai bentuk pemilihan enzim, yang melibatkan menghubungkan aktiviti enzim dengan pertumbuhan sel. Kaedah ini boleh digunakan sebagai strategi pemilihan pemprosesan tinggi, dan boleh dicapai dengan sama ada memastikan pertumbuhan bergantung pada sintesis produk oleh enzim sasaran atau dengan menghubungkan aktiviti enzim dengan keadaan tenaga global sel. Biologi sintetik boleh digunakan untuk merekayasa strain yang sesuai untuk pemilihan gandingan pertumbuhan, dan kemajuan terkini telah memberi tumpuan kepada merekayasa strain yang kekurangan dalam keadaan teroksida atau tereduksi pasangan kofaktor redoks, yang boleh berfungsi sebagai platform kejuruteraan enzim. Penggunaan platform ini boleh mempercepatkan pembangunan biopemangkin dan bioproses yang lebih baik.

Faedah gandingan pertumbuhan melalui auksotrofi kofaktor

Faedah menggunakan auksotrofi kofaktor sebagai kaedah pemilihan untuk kejuruteraan enzim yang terlibat dalam biosintesis bahan kimia tertentu, seperti lipid, biofuel, gas, pelarut organik, atau sebatian polimer. Pendekatan ini menawarkan beberapa faedah unik, termasuk keupayaan untuk memilih produk yang diingini secara bebas daripada substrat atau produk yang diminati, menjadikannya lebih mudah untuk mengesan aktiviti enzim yang lebih baik, dan menawarkan bacaan untuk mengesan aktiviti enzim yang lebih baik. Selain itu, penggunaan auksotrof kofaktor sebagai platform gandingan pertumbuhan adalah bermanfaat kerana sifat sejagat kofaktor redoks dalam metabolisme mikrob bermakna strategi kejuruteraan boleh dipindahkan secara lateral kepada mikrob lain yang diminati, dan enzim boleh direkayasa secara langsung dalam persekitaran hos mikrob yang diingini. (ditunjukkan sebagai rajah 1)

Rajah 1: Perbandingan beberapa teknik saringan/pemilihan yang digunakan secara meluas untuk kejuruteraan enzim

Mutant yang kekurangan dalam pengoksidaan NADH

Pengoksidaan NADH dalam E. coli boleh berlaku melalui dua laluan, bergantung pada ketersediaan oksigen. Di bawah keadaan aerobik, NADH terutamanya dioksidakan melalui respirasi untuk menjana ATP, manakala di bawah keadaan anaerobik, ia boleh dioksidakan melalui laluan penapaian untuk menghasilkan laktat dan etanol. Strain mutan E. coli, yang tidak dapat menggunakan laluan penapaian campuran untuk pengoksidaan NADH semasa pertumbuhan anaerobik, telah digunakan untuk memacu laluan pengoksidaan NADH untuk sintesis anaerobik pelbagai bahan kimia, seperti 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butanadiol, 1-butanol, dan L-alanina. Strain mutan ini juga telah digunakan untuk merekayasa enzim dengan memanfaatkan prinsip redoks yang serupa, menghasilkan varian yang lebih baik. Strain yang terhasil boleh digunakan untuk merekayasa enzim dan laluan lain yang bergantung kepada NAD(P)H.

Mutant yang kekurangan dalam penurunan NAD+

Wenk et al. mencipta strain E. coli dengan memadamkan gen dihidrolipoil dehidrogenase (lpd), yang menyebabkan strain tersebut tidak dapat menjana kuasa penurunan (NADH dan NADPH) daripada metabolisme asetat kerana ketiadaan aktiviti piruvat dehidrogenase. Ini menyebabkan strain tersebut menunjukkan auksotrofi untuk kuasa penurunan apabila ditanam secara aerobik pada asetat sebagai sumber karbon tunggal. (ditunjukkan sebagai rajah 2) Strain tersebut dapat tumbuh pada asetat apabila ditambah dengan substrat glikolitik atas atau apabila mengekspresikan dehidrogenase formiat-, etanol- atau metanol yang bergantung kepada NAD+ dengan substrat masing-masing. Strain tersebut tidak digunakan untuk kejuruteraan enzim dan hanya dinilai untuk auksotrofi kofaktor redoks.
 

Rajah 2: Metabolisme Pusat

Mutant yang kekurangan dalam pengoksidaan NADPH

Terdapat dua strategi berbeza untuk mendorong auksotrofi NADP+ dalam E. coli, bergantung pada merekayasa laluan glikolitik untuk menghasilkan NADPH secara berlebihan. Strategi pertama melibatkan pemadaman gen gapA asli dan mengekspresikan enzim GAPDH yang bergantung kepada NADP+ heterolog, manakala strategi kedua melibatkan mengarahkan semula fluks karbon melalui laluan pentosa fosfat. Strain yang terhasil tidak dapat tumbuh pada glukosa tetapi menunjukkan pertumbuhan dalam keadaan yang berbeza, dengan strain pertama ditanam di bawah keadaan anaerobik dan yang kedua di bawah keadaan aerobik dengan gliserol sebagai substrat. Strain ini digunakan untuk merekayasa enzim dengan sifat yang lebih baik, termasuk kekhususan substrat, aktiviti pemangkinan, dan kestabilan terma.

Mutant yang kekurangan dalam penurunan NADP+

Tiga bakteria berbeza, E. coli, P. putida, dan C. glutamicum, telah direkayasa untuk menjadi auksotrof NADPH, bermakna mereka memerlukan NADPH eksogen untuk pertumbuhan. Dalam kes E. coli dan C. glutamicum, enzim metabolik pusat telah dimatikan untuk mengelakkan penurunan NADP+ apabila glukosa disediakan sebagai sumber karbon, manakala dalam P. putida, kejuruteraan berbantukan CRISPR/nCas9 digunakan untuk mengganggu set gen sasaran secara berurutan untuk memahami penglibatan mereka dalam metabolisme redoks. Strain auksotrof NADPH kemudian digunakan untuk kejuruteraan enzim gandingan pertumbuhan berdasarkan kekhususan kofaktor. Satu pusingan mutagenesis menggunakan E. coli menghasilkan dehidrogenase formiat yang bergantung kepada NADP+ yang paling cekap dan spesifik setakat ini, manakala P. putida dan C. glutamicum mewakili strain pertama spesies mereka yang boleh digunakan untuk jenis kejuruteraan ini.

Mutant yang kekurangan dalam penurunan NMN+

Satu sistem pemilihan gandingan pertumbuhan telah dibangunkan untuk menghubungkan kitaran kofaktor dan pertumbuhan berdasarkan kekurangan dalam pengurangan NMN+. Strain E. coli SHuffle digunakan, yang membawa pemadaman dalam dua gen yang terlibat dalam penghasilan glutation terkurang. Glutation reduktase bergantung NMNH telah dibangunkan melalui mutagenesis rasional untuk menghubungkan proses kepada kitaran NMN+/NMNH, dan glukosa dehidrogenase bergantung NMN+ digunakan untuk menyokong kitaran kofaktor NMN+/NMNH dan oleh itu pertumbuhan. Kajian ini juga menggunakan auksotrofi kofaktor redoks bukan kanonik untuk kejuruteraan enzim gandingan pertumbuhan buat kali pertama, menghasilkan varian fosfit dehidrogenase termostabil dengan kecekapan pemangkin yang lebih baik dan kestabilan temporal secara in vitro. Kerja ini menyediakan strain yang berguna untuk kejuruteraan enzim gandingan pertumbuhan, bergantung kepada kitaran NMN+/NMNH dan auksotrofik untuk keadaan terkurang kofaktor redoks bukan kanonik.

Potensi gandingan pertumbuhan melalui kofaktor redoks berfungsi sebagai alat yang berkuasa untuk merekayasa biopemangkin, terutamanya dalam konteks biopengeluaran lestari. Walaupun kemajuan yang besar telah dicapai dalam penjanaan strain auksotrofik kofaktor redoks, kenyataan itu mencadangkan bahawa masih terdapat beberapa laluan penyelidikan yang belum diterokai. Salah satunya melibatkan kejuruteraan strain auksotrofik kofaktor organisma selain E. coli, yang boleh membuka kemungkinan baru untuk kejuruteraan enzim gandingan pertumbuhan.

Secara keseluruhan, ia mencadangkan bahawa penggunaan gandingan pertumbuhan berasaskan kofaktor redoks mewakili peluang besar untuk merekayasa biopemangkinan, terutamanya untuk penghasilan produk yang tidak dapat memenuhi keperluan pendekatan kejuruteraan enzim pemprosesan tinggi yang lain. Ia menekankan keperluan untuk membangunkan biopemangkin yang lebih serba boleh dan cekap untuk biopengeluaran lestari dan menekankan kepentingan penyelidikan berterusan dalam bidang ini.


Rujukan: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Kejuruteraan enzim gandingan pertumbuhan melalui manipulasi penjanaan semula kofaktor redoks, Kemajuan Bioteknologi, 2023.