Kuantifikasi NAD+ dan Metabolitnya dalam Saraf Sciatic Tikus
引言
Bahagian penting nikotinamida adenina dinukleotida (NAD+) dan metabolitnya dalam penuaan dan neurodegenerasi telah diiktiraf secara meluas. Untuk merangsang kemajuan ke arah penyelidikan biokimia dan intervensi yang menyasarkan penyakit penuaan dan neurodegeneratif, adalah amat penting untuk mengukur dengan tepat tahap NAD+ dan metabolitnya dalam laluan penyelamatan NAD+. Di sini, kaedah LC-MS/MS yang mantap dan tepat digunakan untuk mengukur tahap NAD+ dan metabolitnya dalam saraf sciatic tikus normal dan cedera.Batasan kaedah sedia ada untuk mengukur NAD+ dan metabolitnya
Kaedah tradisional untuk mengukur NAD+ dan metabolitnya, seperti HPLC-UV, NMR, elektroforesis zon kapilari, atau ujian enzimatik kolorimetrik, menghadapi pelbagai cabaran dalam kepekaan, selektiviti, dan pengukuran tidak langsung. Bagi ujian LC-MS/MS sedia ada untuk pengukuran NAD+ dan metabolitnya dalam sel atau tisu, masih terdapat banyak kesukaran untuk diatasi, seperti masa larian yang panjang, tingkah laku pengekalan kromatografi yang lemah, dan bentuk puncak yang tidak memuaskan. Selain itu, hanya satu hingga tiga bahan dalam laluan penyelamatan NAD+ boleh diliputi oleh kaedah ini.Pengubahsuaian kaedah LC-MS/MS
Berdasarkan ujian LC-MS/MS sedia ada, pengubahsuaian mengenai keadaan kromatografi, matriks pengganti, dan keadaan MS/MS dijalankan. Secara khusus, 5 μM asid metilena fosfonik digunakan sebagai bahan tambahan fasa bergerak, yang secara jelas meningkatkan keamatan isyarat dan bentuk puncak. Memandangkan sifat sampel saraf yang agak bersih dan ringkas serta saiznya yang kecil, air ultra tulen diuji sebagai matriks pengganti. Daripada menggunakan lajur kromatografi cecair interaksi hidrofilik dan lajur hiperkarb, lajur Waters Atlantis Premier BEH C18 AX digunakan, yang teknologi permukaan berprestasi tinggi MaxPeak HPS yang unik (pempasifan dinding dalam lajur, menghapuskan permukaan logam) membolehkan kebolehulangan yang tinggi, simetri puncak, dan pemisahan garis dasar semua analit.Selain itu, keadaan MS dioptimumkan untuk meminimumkan isyarat gangguan NAD+ dalam saluran adenosina difosfat ribosa siklik (cADPR) sambil mengekalkan tindak balas cADPR dan nikotinamida mononukleotida (NMN), dengan 4000V untuk voltan semburan ion, 450℃ untuk suhu pemanas turbo, 50 psi untuk Gas 1, 50 psi untuk Gas 2, 30 psi untuk gas kurtin, dan 12 psi untuk gas perlanggaran.
Kromatogram wakil sampel saraf (normal vs cedera)
Kesemua lima analit mencapai pemisahan garis dasar, di mana cADPR adalah biomarker sensitif dalam model neurodegenerasi. Di sini, aksotomi saraf sciatic mendorong degenerasi akson, menyebabkan tahap NAD+ berkurangan dan tahap NMN meningkat dalam saraf yang cedera, menghasilkan peningkatan kira-kira 2 kali ganda dalam nisbah NMN/NAD+. Pada masa yang sama, tahap nikotinamida (NAM) dan adenosina difosfat ribosa (ADPR), berkurangan kira-kira 2 kali ganda, manakala tahap cADPR meningkat lebih daripada 8 kali ganda. Keputusan ini konsisten dengan penyelidikan yang dilaporkan sebelum ini, mengesahkan ketepatan kaedah LS-MS/MS yang diubah suai ini dalam mengukur NAD+ dan metabolitnya.
Kesimpulan
Kaedah LC-MS/MS yang diubah suai ini membolehkan pemisahan garis dasar yang berkesan bagi NAD+, NMN, NAM, ADPR, dan cADPR dalam masa larian yang singkat iaitu 5 minit, yang menyumbang kepada diagnosis awal pelbagai gangguan neurologi dan pembangunan ubat untuk penyakit penuaan dan neurodegeneratif.Rujukan
Ma Y, Deng L, Du Z. Pembangunan dan pengesahan kaedah LC-MS/MS untuk mengukur NAD+ dan metabolit berkaitan dalam saraf sciatic tikus dan aplikasinya kepada model haiwan kecederaan saraf. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACtelah berdedikasi kepada R&D, pembuatan dan penjualan bahan mentah untuk koenzim dan produk semula jadi sejak 2012, dengan kilang milik sendiri, lebih 170 paten global serta pasukan R&D yang kuat. BONTAC mempunyai pengalaman R&D yang kaya dan teknologi termaju dalam biosintesisNAD dan prekursornya(cth. NMN dan NR). Terdapat pelbagai jenis NAD untuk dipilih, merangkumi NAD Gred ER (penyingkiran endotoksin), NAD Gred I (serbuk mentah IVD/suplemen diet/kosmetik), NAD Gred II (API/perantaraan) dan NAD Gred IV (jika terdapat keperluan yang lebih tinggi terhadap keterlarutan), yang boleh disediakan dalam bentuk serbuk kering beku atau serbuk kristal. Ketulenan BONTAC NAD boleh mencapai melebihi 98%.
