Pengukuran NAD+ dan Metabolitnya dalam Saraf Sciatic Tikus
Pengenalan
Bahagian penting nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) dan metabolitnya dalam penuaan dan neurodegenerasi telah diiktiraf secara meluas. Untuk merangsang kemajuan ke arah penyelidikan biokimia dan intervensi yang menyasarkan penuaan dan penyakit neurodegeneratif, adalah sangat penting untuk mengukur NAD+ dan tahap metabolitnya dengan tepat dalam laluan penyelamatan NAD+. Di sini, kaedah LC-MS/MS yang kukuh dan tepat digunakan untuk mengukur NAD+ dan tahap metabolitnya dalam saraf sciatic tikus yang normal dan yang cedera.Had kaedah sedia ada untuk mengkuantifikasikan NAD+ dan metabolitnya
Kaedah tradisional untuk mengkuantifikasi NAD+ dan metabolitnya, seperti HPLC-UV, NMR, elektroforesis zon kapilari, atau ujian enzimatik kolorimetri, menghadapi pelbagai cabaran dalam kepekaan, selektiviti, dan pengukuran tidak langsung. Bagi ujian LC-MS/MS sedia ada untuk NAD+ selular atau tisu dan pengukuran metabolitnya, masih banyak kesukaran yang perlu diatasi, seperti masa operasi yang panjang, tingkah laku pengekalan kromatografi yang lemah, dan bentuk puncak yang tidak memuaskan. Selain itu, hanya satu hingga tiga bahan dalam laluan penyelamatan NAD+ boleh diliputi oleh kaedah ini.Pengubahsuaian kaedah LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Selain itu, keadaan MS dioptimumkan untuk meminimumkan isyarat gangguan NAD+ dalam saluran kitaran adenosin difosfat ribosa (cADPR) sambil mengekalkan tindak balas cADPR dan nikotinamida mononukleotida (NMN), dengan 4000V untuk voltan semburan ion, 450°C untuk suhu pemanas turbo, 50 psi untuk Gas 1, 50 psi untuk Gas 2, 30 psi untuk gas langsir, dan 12 psi untuk gas perlanggaran.
Kromatogram wakil sampel saraf (normal vs cedera)
Kelima-lima analit mencapai pemisahan asas, di mana cADPR adalah biomarker sensitif dalam model neurodegenerasi. Dalam hal ini, aksatomi saraf sciatic menyebabkan degenerasi aksonal, menyebabkan paras NAD+ berkurang dan tahap NMN yang meningkat pada saraf yang cedera, menghasilkan peningkatan kira-kira 2 kali ganda dalam nisbah NMN/NAD+. Pada masa yang sama, paras nikotinamida (NAM) dan adenosin difosfat ribosa (ADPR) dikurangkan kira-kira 2 kali ganda, manakala tahap cADPR meningkat lebih daripada 8 kali ganda. Keputusan ini konsisten dengan kajian yang dilaporkan sebelum ini, mengesahkan ketepatan kaedah LS-MS/MS yang diubah suai ini dalam mengkuantifikasi NAD+ dan metabolitnya.
Kesimpulan
Kaedah LC-MS/MS yang diubah suai ini membolehkan pemisahan asas NAD+, NMN, NAM, ADPR, dan cADPR yang berkesan dalam masa singkat 5 minit, yang menyumbang kepada diagnosis awal pelbagai gangguan neurologi dan pembangunan ubat untuk penuaan dan penyakit neurodegeneratif.Rujukan
Ma Y, Deng L, Du Z. Pembangunan dan pengesahan kaedah LC-MS/MS untuk mengukur NAD+ dan metabolit berkaitan dalam saraf sciatic tikus dan aplikasinya pada model haiwan kecederaan saraf. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC telah didedikasikan untuk R&D, pembuatan dan penjualan bahan mentah untuk koenzim dan produk semula jadi sejak 2012, dengan kilang milik sendiri, lebih 170 paten global serta pasukan R&D yang kukuh. BONTAC mempunyai pengalaman R&D yang kaya dan teknologi canggih dalam biosintesis NAD dan pendahulunya (cth. NMN dan NR). Terdapat pelbagai jenis NAD yang perlu dipilih, termasuk NAD Gred ER (penyingkiran endoksin), NAD Gred I (IVD/suplemen diet/serbuk mentah kosmetik), NAD Gred II (API/perantaraan) dan NAD Gred IV (jika ada keperluan lebih tinggi untuk kelarutan), yang boleh disediakan dalam bentuk serbuk liofilisasi atau serbuk kristalin. Ketulenan BONTAC NAD boleh melebihi 98%.
