Pengoptimuman Keadaan Tindak Balas untuk Mencapai Hasil Tinggi Stevia Rebaudioside D
Diet tinggi gula telah menyebabkan peningkatan prevalens pelbagai penyakit kronik, termasuk obesiti, diabetes, penyakit kardiovaskular, dan hipertensi, menimbulkan kebimbangan kesihatan awam global yang ketara. Stevia Rebaudioside D (Reb D), pemanis semula jadi yang diperoleh daripada tumbuhan, telah mendapat perhatian besar sebagai pengganti gula kerana kandungan sifar kalori, kemanisan yang kuat, dan profil rasa yang menyenangkan.
Walau bagaimanapun, kehadiran terhadnya dalam stevia rebaudiana Bertoni dan cabaran berkaitan kelarutan rendah serta aktiviti enzimatik glikosiltransferase yang berasal dari tumbuhan telah menghalang aplikasi komersialnya yang meluas. Sebagai tindak balas kepada isu-isu ini, satu glikosiltransferase baru yang dipanggil YojK, yang berasal dari Bacillus subtilis 168, telah ditemui. Kajian ini memperkenalkan glikosiltransferase bakteria yang diubah suai secara genetik, YojK-I241T/G327N, yang dicirikan oleh kelarutan tinggi dan kecekapan katalitik, menawarkan potensi besar untuk pengeluaran Reb D berskala industri.
Pembangunan kaedah yang sangat cekap untuk penghasilan rebaudioside D menggunakan tindak balas berantai enzim YojK-I241T/G327N dan AtSuSy.
Untuk menangani isu kelarutan rendah dalam glikosiltransferase yang berasal dari tumbuhan, para penyelidik menyiasat potensi penggunaan YojK, O-glikosiltransferase daripada Bacillus subtilis 168. YojK dipilih kerana aktiviti glikosilasi yang terbukti dengan pelbagai substrat, termasuk molekul besar. Selepas ekspresi dan penulenan rekombinan yang berjaya, YojK digunakan untuk mengglikosilasi Reb A, menghasilkan Stevia Reb D. Analisis kinetik enzim mendedahkan bahawa YojK mempunyai aktiviti katalitik yang lebih rendah terhadap Reb D berbanding glikosiltransferase lain. Oleh itu, kajian ini mencadangkan keperluan kejuruteraan berpandu struktur untuk meningkatkan aktiviti katalitik YojK bagi aplikasi praktikal yang berpotensi. (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1)
Rajah 1
Pengoptimuman keadaan tindak balas untuk mencapai hasil rebaudiosida D yang tinggi.
Keadaan tindak balas, termasuk pH, suhu, dan kepekatan substrat, boleh dioptimumkan untuk mencapai hasil tinggi Srevia Reb D. Kajian ini menggunakan simulasi dinamik molekul untuk menyiasat bagaimana varian YojK-I241T/G327N meningkatkan glikosilasi Reb D. Varian ini mengekalkan ikatan hidrogen yang stabil antara Reb A dan H14 semasa simulasi, berbeza dengan jenis liar (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2). Kestabilan ini juga meliputi jarak antara atom O2 Reb A dan C1P UDPG. Peningkatan kecekapan katalitik varian YojK-I241T/G327N dikaitkan dengan interaksi stabil ini, menunjukkan potensi praktikalnya.
Rajah 2
Rajah 3
Kesimpulan
Pendekatan ini menghasilkan 83.47% Reb D. Menariknya, menambah 1 mM UDPG membolehkan sintesis 20.59 g/L Reb D dengan hasil luar biasa 91.29%, mengatasi kajian sebelumnya. Proses ini menunjukkan potensi pengeluaran Reb D berskala industri, terutamanya selepas kejuruteraan struktur YojK.YojK boleh dinyatakan dengan cekap dalam E. coli BL21 (DE3) dengan kelarutan yang tinggi. Melalui kejuruteraan berpandu struktur, mutan berganda, YojK-I241T/G327N, telah diwujudkan, membolehkan pengeluaran besar-besaran Reb D dengan hasil luar biasa sebanyak 91.29% melalui kitar semula UDPG yang dikatalisis oleh sukrosa sintase AtSuSy. Kajian ini mempersembahkan YojK-I241T/G327N sebagai alat yang menjanjikan untuk pengeluaran Reb D berskala industri yang berkesan dari segi ekonomi.
